這是關(guān)于CO2培養(yǎng)的三部分系列中的**篇
生物污染是每個使用細胞培養(yǎng)的人的恐懼。當(dāng)培養(yǎng)物被微生物感染或被外來細胞交叉污染時，這些培養(yǎng)物通常必須被破壞。由于培養(yǎng)物污染的來源是普遍存在的以及難以鑒定和消除，所以沒有細胞培養(yǎng)實驗室不受這種擔(dān)心的影響。隨著細胞培養(yǎng)物用于生物研究，疫苗生產(chǎn)和用于個性化醫(yī)療和新興再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用的治療性蛋白質(zhì)的生產(chǎn)的持續(xù)增加，培養(yǎng)物污染仍然是非常重要的問題。
介紹
細胞培養(yǎng)正在繼續(xù)60年的趨勢，在學(xué)術(shù)研究，治療醫(yī)學(xué)和藥物發(fā)現(xiàn)中越來越多地使用和重要性，伴隨著放大的經(jīng)濟影響。1,2新的治療，疫苗和藥物，以及再生和合成器官，將日益來自培養(yǎng)的哺乳動物細胞。隨著細胞培養(yǎng)技術(shù)的更大的使用和熟練，更好地理解與細胞培養(yǎng)物污染相關(guān)的危險和問題。在21世紀，有更好的測試方法和預(yù)防工具，并且對污染的風(fēng)險和影響的認識要求細胞培養(yǎng)者保持警惕; 未檢測到的污染可能具有廣泛的下游效應(yīng)。
生物污染：一個常見的伴侶
在1928年青霉素的機會發(fā)現(xiàn)是罕見的事件，大多數(shù)研究人員只能夢想。從一個暑假返回后，他不小心留下了一套在實驗室角落堆積的培養(yǎng)皿，亞歷山大·弗萊明發(fā)現(xiàn)了20世紀**強大的藥物之一。弗萊明注意到他的一個細菌培養(yǎng)物被真菌污染，但是真菌周圍的葡萄球菌的菌落已被破壞。真菌當(dāng)然是Penicillium notatum，弗萊明繼續(xù)發(fā)現(xiàn)抗生素。然而，這是污染的一個非常罕見的例子，實際上推動了科學(xué)研究的道路。在大多數(shù)情況下，文化的污染仍然是每一個科學(xué)家**糟糕的噩夢。Carolyn Kay Lincoln和Michael Gabridge在1998年總結(jié)了這個問題：“細胞培養(yǎng)污染仍然是基礎(chǔ)研究工作臺以及生物制品制造商的主要問題。污染是真正危及使用細胞培養(yǎng)作為可靠的試劑和工具。“ 3
哺乳動物細胞培養(yǎng)物的生物污染比你想象的更常見。在20世紀90年代中期報道的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，美G實驗室中11％**15％的培養(yǎng)物感染了支原體物種。4即使有更好的認識到問題和商業(yè)準備試劑和媒體的更嚴格的測試，研究實驗室培養(yǎng)支原體生長的發(fā)病率在**近一項研究中，23％5，2010年文化的一個驚人的8.45％的市場來自生物制藥測試來源被真菌和細菌污染，包括支原體。6
在研究實驗室，污染不僅僅是偶爾的刺激，但它可以花費寶貴的資源，包括時間和**。**終，污染會影響研究團體或特定科學(xué)家的可信度; 出版物有時必須撤回，因為擔(dān)心回溯性樣品污染或報告的結(jié)果是偽像。在生物制藥制造中，當(dāng)整個生產(chǎn)運行必須被丟棄時，污染可以具有甚**更顯著的效果。因此，了解樣品污染如何發(fā)生以及可用于限制和**終防止樣品污染的方法是非常重要的。
什么原因?qū)е律镂廴荆?/p>
生物污染物可以分為兩個亞類，取決于在培養(yǎng)物中檢測它們的容易性，**簡單的是大多數(shù)細菌和真菌。那些更難以檢測，從而存在潛在的更嚴重的問題，包括支原體，病毒和其他哺乳動物細胞的交叉污染。
細菌和真菌
細菌和真菌，包括霉菌和酵母，在環(huán)境中是普遍存在的，并且能夠在富含細胞培養(yǎng)環(huán)境中快速建群和繁殖。它們的小尺寸和快速生長速率使得這些微生物是**常遇到的細胞培養(yǎng)污染物。在不存在抗生素的情況下，通常通過顯微鏡觀察或通過它們對培養(yǎng)物的直接作用（pH變化，混濁和細胞死亡）在污染的幾天內(nèi)在培養(yǎng)物中檢測細菌。酵母通常導(dǎo)致生長培養(yǎng)基變得非常混濁或渾濁，而霉菌將產(chǎn)生分枝的菌絲體，其**終表現(xiàn)為漂浮在培養(yǎng)基中的毛叢。
支原體
支原體肯定是所有生物污染物中**嚴重和**普遍的，因為它們的低檢測率及其對哺乳動物細胞的作用。雖然支原體在技術(shù)上是細菌，但它們具有使它們獨特的某些特征。它們比大多數(shù)細菌（0.15**0.3μm）小得多，因此它們可以生長**非常高的密度，沒有任何可見的跡象。它們還缺乏細胞壁，并且與它們的小尺寸相結(jié)合意味著它們有時可以滑過用于滅菌的濾膜的孔。由于**常見的抗生素靶向細菌細胞壁，所以支原體是抗性的。
支原體對任何細胞培養(yǎng)物都是非常有害的：它們影響宿主細胞的代謝和形態(tài)，引起染色體畸變和損傷，并且可以引起細胞病變反應(yīng)，使來自污染培養(yǎng)物的任何數(shù)據(jù)不可靠。在歐洲，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)支原體污染水平極高 - 在25％和40％之間 - 日本報告的比率高達80％.4美G和世界其他地區(qū)之間的差異可能是由于使用測試程序。統(tǒng)計顯示，常規(guī)檢測支原體污染的實驗室發(fā)病率低得多; 一旦檢測到，可以包含和消除污染。支原體的測試應(yīng)**少每月進行一次，并且有廣泛的市售試劑盒。確保物種檢測的**方法是使用**少兩種不同的測試方法，例如DAPI染色和PCR。5
病毒
像支原體，病毒不提供視覺提示他們的存在; 它們不改變培養(yǎng)基的pH或?qū)е聹啙帷Ｓ捎诓《臼褂闷渌拗鬟M行復(fù)制，因此用于阻斷病毒的藥物對所培養(yǎng)的細胞也具有高毒性。然而，對宿主細胞造成損害的病毒傾向于是自限性的，因此病毒污染的主要問題是它們感染實驗室人員的可能性。那些使用人類或其他靈長類動物細胞的人必須采取額外的安全預(yù)防措施。
其他哺乳動物細胞類型
細胞培養(yǎng)物與其他細胞類型的交叉污染是一個嚴重的問題，其**近才被認為是令人擔(dān)憂的。7,8據(jù)估計，目前使用的15％**20％的細胞系被錯誤識別9,10，這是從**個人類細胞系HeLa開始的一個問題，HeLa是從Henrietta Lacks在1952年分離的異常侵襲性子宮頸腺癌。HeLa細胞所以積極，一旦偶然引入一種文化，他們很快過度生長的原始細胞。但問題不僅限于HeLa; 存在許多被表征為內(nèi)皮細胞或前列腺癌細胞但實際上是膀胱癌細胞的細胞系的實例，其特征為乳腺癌細胞，但實際上是卵巢癌細胞。在這些情況下，當(dāng)外源細胞類型更好地適應(yīng)培養(yǎng)條件時，出現(xiàn)問題，并且因此替代培養(yǎng)物中的原始細胞。這種污染明顯地對所產(chǎn)生的研究的質(zhì)量提出了問題，并且使用包含錯誤細胞類型的培養(yǎng)物可能導(dǎo)致公開結(jié)果的收回。
實驗室中的生物污染源
為了減少生物污染的頻率，重要的是要了解生物污染物如何進入培養(yǎng)皿。在大多數(shù)實驗室中，微生物的**大來源是伴隨實驗室人員的微生物。這些在正常實驗室工作期間作為空氣懸浮顆粒和氣溶膠循環(huán)。說話，打噴嚏和咳嗽可以產(chǎn)生大量的氣溶膠。服裝也可以從實驗室外攜帶和運輸一系列微生物，因此在細胞培養(yǎng)實驗室工作時穿戴實驗室外套是**關(guān)重要的。即使只是在實驗室周圍移動也可以產(chǎn)生空氣運動，所以房間必須經(jīng)常清潔以減少灰塵顆粒。
某些實驗室設(shè)備，例如移液裝置，渦流器或沒有生物容器的離心機可以產(chǎn)生大量的載有微生物的顆粒和氣溶膠。經(jīng)常使用的實驗室設(shè)備，包括水浴，冰箱，顯微鏡和冷藏室，也是微生物和真菌的儲存庫。不適當(dāng)清潔和維護的培養(yǎng)箱可以作為真菌和細菌的可接受的家。在滅菌過程中在高壓釜中材料的過度擁擠也可導(dǎo)致微生物的不完全消除。
培養(yǎng)基，牛血清，試劑和塑料制品也可以是生物污染物的主要來源。雖然商業(yè)測試方法比早期幾十年有所改進，但使用經(jīng)認證可用于細胞培養(yǎng)的材料是**關(guān)重要的。在同時使用多個細胞系時可能發(fā)生交叉污染。每個細胞類型應(yīng)該有自己的解決方案和供應(yīng)，應(yīng)該與其他細胞分開操縱。在常規(guī)細胞培養(yǎng)程序中非故意使用非消毒用品，培養(yǎng)基或溶液是微生物擴散的主要來源。
結(jié)論
污染是細胞培養(yǎng)中的普遍問題，并且有效地管理任何風(fēng)險以維持實驗完整性是**關(guān)重要的。抗生素可以使用幾周，以確保已知的微生物污染的解決; 然而，應(yīng)避免常規(guī)使用。定期包含抗生素不僅選擇耐藥性生物，而且還掩蓋了無菌技術(shù)中的任何低水平感染和習(xí)慣性錯誤。
對抗污染的**佳方法是每個人保留所有細胞培養(yǎng)工作的記錄，包括每個通道，一般細胞外觀和操作，包括細胞的進食，分裂和計數(shù)。如果發(fā)生污染，請記錄特性，時間和日期。以這種方式，任何污染物可以在其發(fā)生時被定位，并且可以對無菌技術(shù)或?qū)嶒炇乙?guī)程進行改進。在本系列的下一篇文章中，我們更詳細地探討了污染預(yù)防的有效措施，特別是二氧化碳培養(yǎng)箱的關(guān)鍵作用。
參考文獻
